阿斯利康科学家对PROTAC成药性问题的见解
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（作者：蔡鑫，来源：分迪科技）
一、背景
近几十年来，小分子药物之外的新疗法取得了重大进展。主要是由于单克隆抗体的应用，其次，是反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）的使用。其它迅速发展的方法，如环或钉合肽，适配体，修饰信使RNA （mRNA）或CRISPR - Cas9等，都面临着包括细胞渗透性、代谢稳定性、治疗指数或口服药物递送等困难的挑战。传统的小分子作为蛋白质功能抑制剂也存在明显的局限性，包括脱靶药理学（可限制给药方案）和蛋白质组中大多数细胞靶点缺乏有效的小分子配体。尽管如此，小分子药物相对新疗法还是具有其独特的优势：1）良好的细胞通透性，以结合细胞内靶蛋白; 2）口服生物利用度高，便于吸收入血，达到治疗组织；3）制造成本低。
靶向嵌合体的蛋白降解剂（PROTAC）是一种新兴的疗法，与抗体或寡核苷酸等大分子药物相比，它保留了其直接作用细胞内或细胞膜上靶蛋白的能力，同时，还兼具了小分子药物口服生物利用度高和制造成本低的优势。作为异双功能分子，PROTAC由三个关键部分组成：靶蛋白（POI）结合配体、E3连接酶结合配体和连接它们的Linker。PROTAC不依靠目标占据来破坏靶蛋白功能，而是通过利用泛素E3连接酶来促进POI的多泛素化及随后通过泛素-蛋白酶体途径（UPS，图1）的降解。这一作用机制具有很强的疾病干预潜力，超越了小分子可能实现的效果。例如，疾病组织中蛋白质浓度的降低可能会带来除简单抑制蛋白质功能以外的益处。此外，PROTAC诱导的靶蛋白降解只需要POI结合剂，而非功能性抑制剂，因此，PROTAC可以利用常规的小分子抑制降解先前被认为是“不可成药”的蛋白。
图1 PROTAC降解靶蛋白的机制
口服给药是大多数慢性病患者首选的给药途径。阻止PROTAC实现其治疗潜力的一项艰巨挑战便是其缺乏与口服药物相关的成药性特征，即Lipinski的“五规则”（Ro5）。许多评论的都谈到了PROTACs的最新进展，本文中我们将从药物化学的角度探讨PROTAC分子的口服生物利用度问题。口服生物利用度体现了药物避开肠道和肝脏代谢的效率，也是药物吸收速率的反应。PROTAC面临着这些相关参数的挑战。此外，我们还将讨论将PROTAC从临床前工具化合物转化为药物的潜在和更广泛的ADME问题。
二、PROTAC的种类
目前，已利用PROTAC成功降解了多种靶蛋白（表1），过去两年中有大量文章报道。迄今为止，大多数PROTACs分子的设计依赖于已知靶蛋白结合配体与一小部分E3连接酶结合配体的组合连接。最早的小分子PROTAC （1）利用MDM2的E3连接酶及其结合配体（nutlin衍生物）降解了雄激素受体（AR）。虽然这为双功能分子利用UPS降解POI提供了概念验证，但1不是一个非常有效的靶蛋白降解剂。最近，报道了使用idasanutlin衍生物作为MDM2结合配体，经优化的MDM2结合配体用于新PROTAC （2）的设计，有效降解了BRD4蛋白。值得注意的是，这些MDM2结合配体不易合成获得，这可能导致了其应用的有限性。
表1 由各种E3结合配体设计的代表性PROTACs分子及降解效果
与含IAP的E3连接酶结合的配体也被报道能诱导靶蛋白有效的降解。早期IAP-PROTAC使用了bestatin配体，但这些化合物降解效率低。最近，报道了一系列使用LCL-161衍生物设计的PROTACs可降解多个靶蛋白，包括BRD4（3），ABL（4），AR和雌激素受体α（ERα，5）。此子系列的PROTACs被称作SNIPERs（specificand nongenetic IAP - dependent protein erasers）。对E3结合配体的进一步优化，得到了ERα降解剂6（A1874），其在体内外均比5的活性强5倍。
我们已知肽配体是含VHL的E3连接酶的结合配体已经有段时间了，但利用小分子设计PROTACs是最近几年才使用的，该小分子的特异选择性是由于结合位点配体的羟基脯氨酸决定的。早期选择性降解BRD4的PROTAC证明了这个小分子VHL结合配体的有效性。那时使用的是对BRD2或BRD3无选择性的BRD4结合配体，但PROTAC分子MZ1（7）证明了其可选择性地降解BRD4蛋白。化合物8在结构上类似于7，但其可以使用点击化学的方法来方便地组装三唑接头。对Linker的优化和VHL结合配体的小修饰产生了有效的PROTAC分子9（ARV-771），其能有效降解啮齿动物细胞中的BRD4蛋白。VHL结合配体的晶体复合物结构为PROTAC分子AT1（10）的设计提供了一些关键相互作用的信息，这使得化合物10也可以降解BET蛋白，与早期PROTAC相比具有更高的BRD4降解选择性。从与靶蛋白溴基结构域结合的配体上的不同部位连接出Linker，也可以调节PROTACs（MZP54，11）降解BRD3/4的选择性。初BET家族外，VHL-PROTAC已被证明可以降解多种其它靶蛋白，包括ERRα（12）、RIPK2（13）、ABL（14，DAS-VHL）、FLT3（15）、FAK（16）和TBK1（17）。中间的Linker通常是醚（如，PEG）或通过酰胺、醚或胺与POI配体连接的烃链的变体。VHL结合配体上的特定连接点对于大多数PROTAC来说是相似的：通过酰胺键与（S）- 叔丁基 -亮氨酸部分连接。然而，最近报道了来自该羟脯氨酸VHL结合配体的VHL-PROTAC的新载体，其可降解BRD7/9（18，VZ185）和AR（19，ARD-69）。利用含CRBN的E3连接酶结合配体设计的早期PROTAC分子，如dBET1（20）和ARV-825（21），它们都选择性地降解BRD4。这些CRBN-PROTAC分别利用沙利度胺和泊马度胺衍生物作为E3结合配体。在来那度胺与泊马度胺的配对比较中，报道了以来那度胺作为E3结合配体降解BET蛋白的BETd-260（22）和QCA-570（23）体外降解效果更好。与VHL-PROTAC类似，CRBN-PROTAC也可以降解多种靶蛋白，如BCL6（24）、CDK8（25）、CDK9（26，27）、PI3K（28）、BTK（29 - 31）、ALK（32）、HDAC6（33）、sirtuin（34）、PCAF/GCN5（35）、pirin（36）和FKBP12F36V（37）。最近，Zhang等人已经证明，以强效雷帕霉素为基础设计的PROTAC分子RC32（38），可通过口服给药（60mg/Kg，BID）促进小鼠体内细胞中的蛋白质降解，且大鼠、猪和恒河猴注射给药也观察到了蛋白降解效果。与VHL-PROTAC的情况一样，Linker主要由烷基或烷氧基组成，且通常含有附加官能团以将POI结合配体连接到E3配体上，如酰胺或三唑。化合物23是一个例外，Linker中吡唑部分的两侧均含有炔基。
三、PROTACs的口服吸收问题
近年来，一些药物在成药性方面的进展已经超越了Lipinski的Ro5或Veber的可旋转键/极性表面区域指南所描述的范围。这些“超越五规则”（bRo5）的药物通常具有700以上的分子量，且有其它违反Lipinski / Veber规则的属性。尽管有这些违规属性，但这些化合物中的许多还是表现出足够的口服生物利用度，可作为口服药物进一步开发。当肠道和肝脏代谢较低时，口服生物利用度主要与药物的吸收函数相关，而Ro5 / Veber指南旨在帮助提供预测药物吸收的描述符。近年来，一些研究小组分析了不同的bRo5化合物集合，以更好地利用计算机模拟来定义这个独特的化学空间中化合物吸收的描述符。
例如，Doak等人整理了Lipinski和Veber最初描述的关键描述符的上边界限制，最近有几个研究组证明，位于该空间的化合物可以通过口服吸收，并试图将其与各种计算模型联系起来。Degoey等人用综合得分AB-MPS来度量，其使用cLogD，芳环数（nAr）和可旋转键数（nRotB），根据公式AB-MPS = Abs（cLogD- 3）+ nAr + nRotB计算得出。AB-MPS得分越低，化合物被吸收的可能性越大。据报道，值≤14的化合物口服吸收的可能性更高。Kihlberg等人对多组中的上边界参数进行了分析，并与原始Veber / Ro5参数相比较，将其绘制在雷达图中。他们的分析表明，尽管一些参数比其它参数（例如NROTB和氢键供体计数）更不灵活，但这些上边界参数可以因所分析化合物组中的分子不同而有所变化。
虽然，最近的一项分析对这些类型指标的有效性提出了挑战，但它们的确是有价值的。因为它们提供了药物设计的指导方针，药物化学家们可以根据这些方针优先设计与合成新化合物，从而获得具有潜在口服吸收的药物。迄今为止，在同行评审的文献中报道的，与PROTAC有关的的体内研究通常是通过肠胃外给药而不是口服给药进行的。口服PROTAC的能力将增加这种新疗法作为治疗药物的吸引力。
为了探索PROTAC在口服生物利用度方面的潜力，我们评估了几种与化合物渗透性/吸收相关的PROTACS的物理化学描述符，包括分子量（MW）、亲脂性（cLogP和cLogD）、氢键供体（HBDs）、氢键受体（HBA）、极性表面积（PSA）、可旋转键（nRotB）、违反Lipinski五规则的条数（Nrule– of -5）和AB-MPS值（表2）。重要的是，这些PROTAC不一定要口服，而是用于验证PROTAC生物学的细胞工具或体内工具。然而，作为优化的工具，表2中的化合物共同形成了一组具有代表性的有效PROTAC，这可能是寻求口服生物可利用PROTAC的起点。
MDM2-PROTACs具有最高的MW，是PROTAC中亲脂性最强的一类。与其它E3子类相比，它们还拥有最高的PSA。此外，它们仅在MDM2配体部分中具有3个芳环，加上高亲脂性和高nRotB（表3），它们的AB-MPS和Nrule – of -5表明这类化合物的口服吸收将是一个很大的障碍。同样地，IAP-PROTAC也表现出高MW、高亲脂性和高nRotB，其口服吸收也一样的具有很大的挑战。VHL-PROTAC的性质方面表现较好，但就平均值而言，仍具有较高的MW和nRotB。一些VHL-PROTAC（如 10，12和18）其HBD和PSA相对较低，但就整体Nrule – of - 5和AB-MPS分数而言，仍然很高。PROTAC （18）具有新的VHL结合配体，在降低PSA和HBD/HBA计数方面具有优势。进一步优化该子系列以降低MW和nRotB，可能有助于获得成药性更高的分子。然而，就平均值而言，VHL-PROTAC 的AB-MPS和Nrule – of -5得分仍然很高，表明口服吸收的可能性还是很低。由于其E3结合配体具有独特的属性，CRBN-PROTAC在口服吸收方面更有优势（表3）。它们的MW可以降至700以下，并且它们具有合理的药物样亲脂性和低HBD / nRotB计数。例如，化合物23和27更可能被口服吸收，其物理化学性质的整体改善证明了这一点。
表3 代表性的E3连接酶结合配体及其性质
MDM2-、IAP-、VHL-和CRBN-PROTACs的计算描述符的平均值可在类似于Kihlberg等人报道的雷达图上总结出来。这里，我们将PROTAC属性与Ro5和bRo5化合物组的上限进行比较（图2）。MDM2-和IAP-PROTAC到达或超过bRo5描述符定义的可接受的口服吸收的上限。VHL-PROTAC更接近，与其它E3结合配体相比，就平均值而言，仍然存在高于上边界的nRotB和更高数量的HBD。总体而言，CRBN-PROTAC更“类药”，其平均HBD和cLogP值落在Ro5边界内。所有这些系列都受到高nRotB和HBA计数的影响，超出这些分析的上限，这表药物化学家可以集中精力在明至少有两个参数方面进一步提高PROTAC的口服吸收性。值得注意的是，表1/2中的PROTAC列表包含了可吸收的外部界限范围（如 6，14和37分子），以及潜在可吸收的范围（如23和27分子）。
值得进一步探索PROTAC的领域是二级结构与ADME特性之间的关系。这些分子大小适中，由于它们的嵌合结构，它们可能因为具有不同程度的柔性而在溶液中呈现不同的构象。尽管具有高nRotB，但其二级结构也可能具有一定程度的刚性，从而影响其代谢或渗透性。例如，最近的报道表明，一定程度的柔性可能会对bRo5空间中的分子产生变色效应，使其能够根据环境显示不同程度的极性，从而从吸收的角度展示其潜在的优势。可以使用分析方法来监测这些现象，包括测量暴露的极性表面积（EPSA）或测量各种介质中的NMR溶液构象。未来的工作重点是更好地理解二级结构与吸收/代谢之间的关系，这将有助于PROTAC设计策略成功地应对口服吸收的挑战。
另一个对吸收和体外分析质量有重要影响的参数是溶解度。如果药物在肠道中没有足够的溶解度，口服吸收将是困难的。此外，由于化合物沉淀和溶液浓度低于预期，在分析介质中溶解度差可能影响测定数据的质量。据报道，CRBN结合配体沙利度胺在一系列pH值下的水溶性较差，这也可能导致其相应的PROTAC溶解性的低下。迄今为止，很少有关于PROTAC溶解度的数据报道。但是，值得欣慰的是，PBS（磷酸盐缓冲盐水）和Linker中含有三唑的一系列降解BRD4的PROTACs的模拟肠液溶解度与具有简单烷基/烷氧基Linker的PROTACs相当。所有这些PROTAC都表现出足够的溶解度以支持类似药物剂量的肠道吸收。除溶解度之外，其它物理化学性质，如化学稳定性、在介质中与组织或蛋白的非特异性结合也可能影响PROTAC的成药性。据报道，沙利度胺的戊二酰亚胺部分容易外消旋化，结构上不稳定，且两种对映体具有不同的生物活性。此外，已有报道，结合CRBN的邻苯二甲酰亚胺和戊二酰亚胺官能团是不稳定的，因为其可在任一酰亚胺部分水解。除非化学稳定性和非特异性结合等问题得到适当的解决，否则，体外试验的数据可能会受到影响，进而会影响研究者解释PK/ PD数据或预测ADME的能力。
表2中所示的物理化学描述符有助于将口服吸收和某些物理化学性质的风险联系起来，但对于超出吸收范围的PROTAC，可能会面临其它方面的挑战。重要的是，口服生物利用度不仅取决于吸收，还依赖于肠道和肝脏的新陈代谢。大多数PROTAC是相对亲脂的（cLogP大于4），因此可能比极性药物具有更高的氧化代谢性。另外，具有线性脂肪链或醚链的Linker预计会有氧化代谢的风险，因为这样的Linker容易接近氧化酶催化位点。因此，为了PROTAC分子能够获得足够的口服生物利用度，还必须关注清除率的经验性减少，通常是在进入体内PK研究之前，用体外试验减少肝微粒体或肝细胞中的未结合清除率。
四、未来的挑战
通过对吸收和代谢的优化，可口服的PROTACs将会成为主流的小分子药物。随着PROTAC进入临床试验，为了给患者提供最佳疾病治疗，未来还有一些尚未解决的问题和关键挑战。
PROTAC特有的一个明显的复杂性就是所谓的“钩子”效应，即体外细胞靶蛋白降解在较高的PROTAC浓度下会减弱，这可能是由于POI-PROTAC或E3-PROTAC二元复合物的竞争性形成的，而不是可降解的POI-PROTAC-E3三元复合物。对于需要较长时间再合成的POI，可以通过管理PROTAC的药代动力学特征来减弱“钩子”效应。对于仅需较短时间再合成的POI，PROTAC诱导的降解速率将与POI再合成竞争，需要稳定的PROTAC浓度来维持预期的PD效应。然而，全身药物浓度的波动是常见的现象，因此如果“钩子”效应在体内转化，则在高药物浓度下，POI的降解可能会减少，且再合成时间较短。有助于体内“钩子”效应的关键药理学参数可能包括对指定的E3连接酶/POI结合配体的动力学和结合亲和力、三元复合物形成的协同性和E3连接酶的表达水平。因此，选择具有最佳协同性的E3连接酶，E3连接酶结合配体和Linker对于减弱这种效应具有重要意义。另外，具有长血浆半衰期（即低峰谷比）的PROTAC有望缓解这种情况下的体内“钩子”效应。
PROTAC实现其最佳体内效果的另一个挑战与三元复合物提供降解的必要性有关。PROTAC将在体内形成代谢物，可能具有维持相关系统浓度的潜力。尽管这些代谢物可能丧失形成有效三元复合物的能力，但它们可能保持对POI或E3连接酶的结合亲和力。因此，它们可能通过与POI或E3连接酶竞争性地形成二元复合物而对PROTAC诱导的降解产生不利影响。或者，代谢物也可能具有安全/毒性风险，因此限制了PROTAC的治疗效益（尽管这不是PROTAC独有的）。故，降低代谢物风险的关键策略是监测它们，并在候选化合物优化过程中尽可能减少代谢物的形成。
迄今为止，PROTACs的研究主要集中在少数几种E3连接酶上，如CRBN和VHL。目前的文献表明，这些E3连接酶在人体中普遍表达，因此设计PROTAC的研究者可能不太关心这些连接酶。然而，随着研究人员发现具有组织特异性表达水平的其它E3连接酶后，需要从药理学/毒理学角度以及ADME的考虑因素来理解不同组织间E3的相对表达。
除了ADME挑战之外，PROTAC还将药物发现工作转移到了有关药物安全方面的未知领域。上面报道的许多PROTAC对其所需的POI表现出优异的降解选择性，但对于它们在大量受体、酶和离子通道中的一般脱靶活性，几乎没有文献报道。由于其相对较高的亲脂性（cLogP > 4，表2），PROTAC可能由于脱靶活性而具有一些次级药理学效果，从而增加了临床环境中剂量限制副作用的风险。此外，PROTAC与指定的E3连接酶的必要结合亲和力也可能是药物安全性问题的一个因素。例如，早期证据表明，一些CRBN-PROTAC可能在诱导锌指家族蛋白降解及其相关药理学方面保留了其药理学性质。最后，尽管与小分子抑制剂相比，PROTACs在诱导POI降解方面更具选择性，但人们仍然担心脱靶蛋白的降解可能导致对正常组织造成的附带损害，即所谓的旁观者效应。另外，PROTAC的任何脱靶受体药理学性质也可能预期转化为临床中潜在的剂量限制作用。面对这些挑战，追求高效特异性药物分子的一般药物发现策略仍然适用。在PROTACs的情况下，这意味着挑选具有选择性和有效的POI配体，将它们与有效的E3连接酶结合配体组合，并优化Linker以最大化协同作用，最终将产生高效和高选择性的蛋白降解剂，以获得最佳的药物开发机会。
五、结论
虽然PROTAC技术是一种相对较新的方法，但在新药开发方面发展迅速。最近，一种雄激素受体降解剂最近作为口服给药的PROTAC进入人体临床试验，从而证明了这种新方法产生口服药物的可能性。此外，它们可以成功地降解多种类型的蛋白，这表明其拥有多个治疗领域中治疗多种疾病的广阔潜力。但是，这种新方法的确面临口服生物利用度，PK / PD / 疗效关系，以及分布、代谢和毒性方面的挑战。随着ADME优化的进一步发展，人们对它的兴趣将会继续暴涨。在未来几年中，对解口服PROTAC的体内疗效和安全性研究的更详细的了解，将有助于揭示其未来的潜力和临床应用的广度。尽管面临挑战，但PROTAC代表着一个全新的领域，以进一步扩可成药的药物。作为一种新疗法，它提供了令人兴奋的潜力，可为需要的患者提供另一种医疗福利。
参考文献
DOI： 10.1016/j.bmcl.2019.04.030
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